Применение лиофилизированной плазмы имеет ряд преимуществ перед свежезамороженной плазмой (СЗП) как для оказания трансфузионной помощи в полевых условиях, так и для проведения диагностических исследований системы гемостаза. Выполнение диагностических исследований требует наличия биологических стандартов, плазмкалибраторов и контрольных материалов с высокой стабильностью целевых показателей при хранении лиофилизированных реагентов. Процесс лиофилизации плазмы вызывает значительные изменения коагулологических показателей и сопровождается повышением ее рН.

Целью работы являлось получение лиофилизированной плазмы крови человека без выраженных при лиофилизации и хранении изменениях активности факторов свертывания крови. Показано, что подкисление пулированной СЗП от не менее 20 доноров перед лиофилизацией до значений рН 7,0–7,1 буферным раствором HEPES в конечной концентрации 50 мМ повышало стабильность факторов системы гемостаза и сохраняло физиологический уровень рН плазмы после лиофилизации. В условиях ускоренного хранения именно такие лиофилизированные плазмы характеризовались большей стабильностью всех определяемых коагулологических показателей. Таким образом, предложенный подход позволяет получать стабильные при хранении лиофилизированные формы диагностических реагентов и контрольных материалов.

Плазма крови человека используется в клинической трансфузионной практике и является объектом диагностики при исследовании нарушений системы гемостаза. В настоящее время наиболее распространенным средством лечения коагулопатий является свежезамороженная плазма (СЗП). Однако ее применение в полевых условиях и в труднодоступной местности имеет ряд ограничений, связанных с хранением и транспортировкой при необходимых для обеспечения функциональной полноценности низких температурах. Указанных недостатков лишена лиофилизированная плазма, которая для своего хранения не требует заморозки и отрицательных температур . Эффективность плазмы крови человека после сублимационной сушки/регидратации показана при лечении больных гемофилией , массивных кровотечений у военнослужащих в полевых условиях . Клиническое применение лиофилизированной плазмы предполагает обеспечение ее патогенной инактивации, что в настоящее время может быть осуществлено различными методами . Лиофилизированная плазма только тогда пригодна для трансфузии, когда в процессе ее приготовления в ней не нарушается баланс свертывающей и противосвертывающей систем. В США запатентован метод получения стабильной вирусинактивированной лиофилизированной плазмы, предназначенной для оказания медицинской помощи в полевых условиях. Показано, что наиболее эффективными стабилизаторами являлись глутамин-дипептиды, глутамин и глицин. Кроме обеспечения гемостатического потенциала, проведенная стабилизация белков плазмы повышала их устойчивость к γ-облучению, что позволяло стерилизовать лиофилизированный препарат. Разработанная лиофилизированная плазма была эффективным средством лечения военнослужащих, получивших ранения в боевых условиях .

Важной областью применения образцов лиофилизированной плазмы является использование их для диагностики нарушений гемостаза. Выполнение таких исследований требует наличия биологических стандартов, плазм-калибраторов и контрольных материалов с высокой стабильностью при хранении. Долгосрочная стабильность и упрощенная логистика транспортировки и распределения реагентов достигаются лиофилизацией таких материалов. Оценку стабильности референсных материалов проводят в тесте ускоренного хранения (accelerated degradation tests) по критериям ВОЗ. Особое значение при получении таких материалов имеет процесс лиофилизации и анализ сублимированных реагентов по специфической целевой активности, остаточной влажности, степени окисления, термическим свойствам. Применение качественных лиофилизированных плазм-калибраторов, субстратных плазм, стандартов, контрольных материалов и диагностикумов является также способом стандартизации исследований, обеспечивающим объективность/ правильность получаемых результатов при клинической диагностике коагулопатий . Одной из основных причин диагностических ошибок при определении параметров свертывающей и противосвертывающей систем крови является недостаточная стабильность используемых в тесте реагентов. Изменения аттестованных значений происходят преимущественно в растворенном состоянии, однако и при хранении лиофилизированных материалов отмечено уменьшение активности различных факторов системы гемостаза . Наиболее выраженные изменения после лиофилизации свежезамороженной вирус-инактивированной плазмы человека были характерны для факторов свертывания. Показано, что после сублимационной сушки и через 10 дней ускоренного хранения при 40°С активность факторов FV, FVII, FVIII, FIX и FX значительно снижалась, что вызывало пролонгирование тестов протромбинового времени (ПВ) и активирован- ного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). При этом наиболее лабильными были FV и FVIII. На активность антитромбина (АТ) III, протеинов C и S лиофилизация значимого влияния не оказывала. Кроме этого в плазме, подвергнутой сублимационной сушке, происходило существенное повышение величины рН с физиологических 7,1–7,4 до щелочных значений порядка 8,5, что, вероятно, и обусловливает снижение активности фак- торов свертывания . Эти изменения определяют необходимость разработки метода производства лиофилизированной плазмы с повышенной стабильностью факторов гемостаза при температуре окружающей среды, физиологических значениях рН и осмолярности. В настоящее время устойчивость гемостати снижались в среднем на 38, 24 и 12% соответственно. Значения АЧТВ и ПВ после лиофилизации повышались на 16 и 11%. При этом значение рН плазмы увеличивалось от 7,35 до 8,2 . С целью повышения буферной емкости к пулированной СЗП до лиофилизации добавляли стабилизатор, буфер HEPES, до конечной концентрации 50 мМ, не изменяя физиологических значений рН 7,3–7,4.

Материал и методы

Лиофилизированную плазму получали из СЗП крови человека, характеризующейся биологической (гемостатической) полноценностью и получаемой согласно существующим требованиям .

В работе применяли СЗП доноров после карантинизации. Для исключения возможных индивидуальных различий используемых доз СЗП исследование проводили на пулированной плазме, объединяя СЗП от не менее 20 доноров. Получение лиофилизированной плазмы проводили следующим образом.

К пулированной СЗП добавляли 40% буферный раствор HEPES до конечной концентрации в плазме 50 мМ. При этом рН плазмы до лиофилизации оставляли в физиологической области 7,35 ± 0,05 (контроль) или подкисляли до 7,0 ± 0,05 (опыт). Полученную плазму разливали по 1 мл в силиконированные стеклянные флаконы, замораживали в лиофильной сушке (“VirTis”, США) со скоростью изменения температуры полки -1 °С в 1 мин от комнатной температуры (24 °С) до -40 °С и выдерживали в течение 3 ч. Первичную сушку проводили при температуре -20 °С в течение 40 ч. Затем темпера- туру повышали до 30 °С и вторичную сушку при этой температуре проводили в течение 10 ч. В этом же режиме проводили лиофилизацию СЗП без добавления стабилизатора.

Измерение активности факторов гемостаза в пробах контрольной и опытной лиофилизированной плазмы после регидратации проводили общепринятыми методами: фибриноген методом Клаусс, FV, FVIII, FIX одностадийным клоттиноговым методом на коагулологическом анализаторе ACL Elite Pro (IL, США) и АТIII – хромо-генным методом. Определяли также ПВ и АЧТВ. Остаточную влажность в лиофилизированной плазме измеряли по методу Фишера. Указанные показатели измеряли в пробах до и после лиофилизации/ регидратации, через 7 сут ускоренного хранения при 37°С, через 2, 4 и 24 ч хранения в разведенном (рабочем) состоянии при 24°С. Статистическую оценку полученных результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты

Лиофилизация пулированной СЗП без добавления стабилизатора вызывала существенные изменения показателей гемостаза. При исследовании 5 пулированных СЗП активность FV, FVIII и содержание фибриногена после сублимационной сушки только до 7,8 ± 0,05. Затем к пулированной СЗП добавляли буферный раствор HEPES таким образом, чтобы до лиофилизации ее рН был равен 7,0–7,1, что обеспечивало в процессе сушки сохранение рН на физиологическом уровне 7,35 ± 0,05. В этих условиях активности FV и FVIII в процессе лиофилизации снижались в меньшей степени, а содержание фибриногена, величин АЧТВ и ПВ практически не изменялись; различие с таковыми в плазме без стабилизатора было статистически значимым. Остаточная влажность получаемых лиофилизированных плазм не превышала 1,5%.

На следующем этапе изучали стабильность лиофилизированной плазмы в зависимости от значений ее рН при ускоренном хранении в течение 7 дней при температуре 37°С.

Анализ показывает, что лиофилизация снижала активность определяемых факторов свертывания и АТ III и повышала значения ПВ и АЧТВ в плазмах с величинами рН до сублимационной сушки и 7,35 ± 0,05 и 7,0 ± 0,05 (после сушки 7,8 ± 0,05 и 7,35 ± 0,05; контроль и опыт соответственно). Статистически значимое уменьшение после лиофилизации отмечено для FV и FVIII (на 28 и 17%) толь- ко в контроле. Отсутствие статистически значимых изменений других определяемых показателей после лиофилизации в контроле может быть обусловлено стабилизирующим действием буфера HEPES и менее щелочным значением рН по сравнению с рН СЗП без стабилизатора после лиофилизации. Вызываемые сублимационной сушкой изменения величин всех гемостазиологических показателей в опытных плазмах были менее выражены по отношению к таковым и в плазме без стабилизатора и в контроле. Уменьшение активности FV и FVIII после лиофилизации плазм с рН до сушки 7,0–7,1 (после сушки 7,3–7,4) составляло только 15 и 5%.

Значительные различия величин коагулологических показателей между контрольными и опытными плазмами отмечены при их хранении в течение 7 дней при 37 °С. По сравнению с показателями в плазме до лиофилизации в контроле активности FV, FVIII и FIX статистически значимо снижались на 49, 45 и 24% соответственно, а значения ПВ и АЧТВ увеличились на 14 и 18%. В плазмах с физиологической величиной рН после сушки (опыт) эти изменения составляли 18, 12, 12, 4 и 4% соответственно. Различия степени стабильности коагулологических показателей при ускоренном хранении между контрольными и опытными плазмами были статистически значимыми (p < 0,05) для FV, FVIII и АЧТВ.

Мы также изучили стабильность показателей в тех же контрольных и опытных образцах плазмы после лиофилизации/регидратации, находящихся в разведенном состоянии при комнатной температуре в течение 1 сут.

Хранение лиофилизированных образцов плазмы после регидратации при комнатной температуре в течение 24 ч вызывало снижение активности FV, FVIII и FIX как в контрольных, так и в опытных образцах плазмы. Статистически значимые различия с таковыми сразу после регидратации отмечены для FV и FVIII только в контроле. Содержание фибриногена, АТIII и значения ПВ и АЧТВ при хранении лиофилизированных образцов плазмы после их регидратации в течение 1 сут при 24 °С практически не изменялось как в контроле, так и в опыте.

Обсуждение

Плазменные факторы свертывания крови являются относительно нестабильными и поэтому требуется добавление к плазме до лиофилизации соединений, способных сохранять их функциональную активность при сублимационной сушке и последующем хранении. В настоящее время разработаны методы повышения стабильности факторов системы гемостаза за счет добавления к плазме агентов, относящихся к «полиолам», таких как сахара (сахароза, тригалоза, маннитол), глутаминдипептиды, глутамин и глицин . В ряде работ показано, что наиболее эффективным стабилизатором гемостатических факторов в процессе лиофилизации и хранения плазмы является глицин. Глицин предотвращал снижение коагулологической активности наиболее лабильных FV и FVIII после лиофилизации и хранения на 21 и 17% соответственно и был самым эффективным из изученных «полиолов» протектором для других плазменных клоттинговых факторов. После сублимационной сушки происходит повышение рН плазмы от физиологических до щелочных значений, что обусловлено практически полной потерей плазмой СО2 в процессе лиофилизации. Эти изменения крайне нежелательны как при лечении больных с помощью лиофилизированной плазмы крови человека, так и при производстве лиофилизированных гемостазиологических референсных материалов с диагностической целью в связи со снижением стабильности показателей гемостаза в такой плазме. Результаты проведенных исследований предполагают, что для предотвращения снижения активности показателей гемоста- за в лиофилизированных референсных материалах при сушке и хранении необходимо стабилизировать белки плазмы и подавлять защелачивание плазмы при лиофилизации. Задачей нашей работы являлось обеспечение сохранности активности показателей гемостаза в лиофилизированных препаратах плазмы с помощью одного активного в этом отношении соединения, а именно концентрированного буферного раствора HEPES.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что подкисление СЗП этим буфером до лиофилизации обеспечивало сохранение активности факторов свертывания в плазмах после сублимационной сушки. Проведенное исследование показало, что повышение буферной емкости плазмы при лиофилизации с помощью буферного раствора HEPES, обеспечивающие физиологические значения рН плазмы после сублимационной сушки, позволило снизить степень изменений коагулологических показателей, вызываемых лиофилизацией. Сохранение физиологических значений рН плазмы после лиофилизации согласно полученным в работе данным обеспечивало стабильность параметров системы гемостаза в условиях ускоренного хранения. По нашему мнению, стабилизирующая белки плазмы способность буфера HEPES и подкисление с его помощью плазмы до лиофилизации обусловливали и сохранение активности факторов свертывания в течение 24 ч после регидратации лиофилизиро- ванной плазмы.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлена возможность сохранения активности коагулологических показателей при лиофилизации пулированной донорской СЗП и ее дальнейшем хранении. Повышенная стабильность системы гемостаза в лиофилизированной плазме достигалась подкислением СЗП до сублимационной сушки концентрированным буферным раствором HEPES, что сохраняло физиологические значения рН плазмы в процессе лиофилизации и хранения. Предлагаемый метод позволяет проводить сублимационную сушку СЗП без значительной потери активности факторов свертывания крови в условиях физиологического рН и длительно хранить такую лиофилизированную плазму без статистически значимых изменений величин ПВ, АЧТВ и активности коагуологических факторов. Данный подход может обеспечить получение стабильных при хранении лиофилизированных форм диагностических реагентов и контрольных материалов. После вирусной инактивации такие лиофилизированные плазмы позволят также увеличить эффективность их клинического приме нения, в частности, в военно-полевых условиях.